Koroonaviiruse replikatsiooni-transkriptsiooni kompleks: NiRAN-RdRp subühikute oluline ja selektiivne NMPüleerimine nsp9 konserveeritud saitidesse

Toimetanud Peter Sarnow, Stanfordi ülikooli meditsiinikool, Stanfordi ülikool, California, heaks kiidetud 25. detsembril 2020 (vaadatud 25. oktoobril 2020)

Me teatame subühikute interaktsioonist koronaviiruste-transkriptsioonikomplekside replikatsioonis, mis on replikatsiooniks ja evolutsiooniliseks säilitamiseks hädavajalikud.Esitasime tõendeid selle kohta, et nsp12-ga seotud NiRAN-domeenil on nukleosiidmonofosfaadi (NMP) transferaasi aktiivsus trans- ja identifitseerisime selle sihtmärgiks nsp9 (RNA-d siduv valk).NiRAN katalüüsib NMP fragmendi kovalentset kinnitumist konserveerunud nsp9 aminootsaga reaktsioonis, mis tugineb Mn2+ ioonidele ja külgnevatele konserveerunud Asn jääkidele.Leiti, et NiRAN-i aktiivsus ja nsp9 NMPülatsioon on koronaviiruse replikatsiooni jaoks hädavajalikud.Andmed võimaldavad meil seostada pesastatud viiruse ensüümmarkeri aktiivsust varasemate tähelepanekutega hüpoteesis, et RNA sünteesi käivitamine RNA viiruste klassis on funktsionaalselt ja evolutsiooniliselt järjepidev.

Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae ja veel 12 perekonda) RNA-sõltuv RNA polümeraas (RdRps) on seotud polüproteiinist vabaneva mittestruktuurse valgu (nsp) aminoterminaalse (N-terminaalse) domeeniga, mida nimetatakse NiRANiks. 1ab koosneb viiruse peamisest proteaasist (Mpro).Varem teatati arteriaalse viiruse NiRAN-RdRp nsp enda GMPüleerimise/UMPüülimise aktiivsusest ja soovitati tekitada ajutine nukleosiidmonofosfaadi (NMP) ülekandmine (praegu teadmata) viiruse ja/või rakkude biopolümerisatsiooni asjadesse.Siin näitame, et koroonaviirusel (inimese koronaviirus [HCoV]-229E ja raske ägeda respiratoorse sündroomi koronaviirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) on Mn2+-sõltuv NMPülatsiooni aktiivsus, mis tuleneb nsp9-st Mpro-vahendatud nsp9 moodustumise kaudu pärast N-otsa külgnev nsps vabaneb proteolüütiliselt, fosforamidaat seotakse nsp9 N-otsas primaarse amiiniga (N3825).Selles reaktsioonis on eelistatud nukleotiid uridiintrifosfaat, kuid sobivad kaassubstraadid on ka adenosiintrifosfaat, guanosiintrifosfaat ja tsütidiintrifosfaat.Mutatsiooniuuringud, milles kasutati rekombinantseid koroonaviiruse nsp9 ja nsp12 valke ning geneetiliselt muundatud HCoV-229E mutante, määrasid kindlaks jäägid, mis on vajalikud NiRAN-vahendatud nsp9 NMPülatsiooniks ja viiruse replikatsiooniks rakukultuuris.Andmed kinnitasid NiRAN-i aktiivse saidi jääkide prognoosi ja määrasid kindlaks nsp9 N3826 jääkide olulise rolli nsp9 NMPülatsioonis ja viiruse replikatsioonis in vitro.See jääk on osa konserveerunud N-terminaalsest NNE tripeptiidjärjestusest ja osutus ainsaks nsp9 ja selle homoloogide muutumatuks jäägiks koroonaviiruse perekonnas.See uuring annab kindla aluse teiste pesastatud viiruste NMPülatsiooni aktiivsuse funktsionaalseks uuringuks ja pakub välja võimalikud sihtmärgid viirusevastaste ravimite väljatöötamiseks.

Nidovirales positiivse ahelaga RNA viirus nakatab mitmesuguseid selgroogseid ja selgrootuid (1, 2).Tellimusse kuulub praegu 14 perekonda (3), kellest koroonaviiruse perekonda on viimase 20 aasta jooksul põhjalikult uuritud.Sel ajal tekkisid loomaperemeestest kolm zoonootilist koroonaviirust, mis põhjustasid inimestel ulatuslikke raskete hingamisteede infektsioonide puhanguid.Sealhulgas rasketest ägedatest nakkushaigustest põhjustatud püsivad pandeemiad.Hingamisteede sündroom koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviirustel on ühine genoomikorraldus ning membraaniga seotud replikatsiooni-transkriptsioonikompleksi (RTC) alaüksus on kodeeritud 5-β²-terminaalses kahes kolmandikus ja viiruseosakese peamises struktuurses allüksuses, samuti mõned lisaseadmed. .Valk, mis on kodeeritud genoomi 3??² lõppkolmandiks (1).Kõik pesastatud viirused, välja arvatud üks planaarsete viiruste perekond (Monoviridae) (8), kodeerivad RTC subühikuid kahes suures avatud lugemisraamis (ORF) ORF1a ja ORF1b, mis on transleeritud genoomsest RNA-st.ORF1a kodeerib polüproteiini (pp) 1a ning ORF1a ja ORF1b ühiselt kodeerivad pp1ab.ORF1a poolt kodeeritud peamise proteaasi (Mpro) üldisel osalusel töödeldakse nii pp1a kui ka pp1ab proteolüütiliselt mitmesugusteks mittestruktuurseteks valkudeks (nsps), mida tuntakse ka kui 3CLpro, kuna sellel on homoloogia pikornaviiruse 3Cproga ( 9).Arvatakse, et need nsp-d on kokku pandud suureks dünaamiliseks RTC-ks, katalüüsivad genoomse RNA sünteesi (replikatsioon) ja subgenoomse RNA komplekti (transkriptsioon) ning neid kasutatakse ORF1b-st allavoolu asuva ORF-i ekspressiooni koordineerimiseks (10 β). ?12).

RTC tuum sisaldab RNA-sõltuvat RNA polümeraasi (RdRp) (13), superperekonna 1 helikaasi (HEL1) (14, 15) ja mitmeid RNA-d töötlevaid ensüüme, mis on peamiselt kodeeritud ORF1b-s ja koroonaviiruse perekonnas See sisaldab nsp12-nsp16 ja nsp9-nsp12 Arterioviridae perekonnas (vt viidet 10ââ 12).RdRp ja HEL1 esindavad kahte (viiendikku) linnupesaviiruse konserveerunud domeeni ja neil on homoloogia teiste RNA viirustega.Arvatakse, et tuuma replikaasi aitavad teised subühikud, sealhulgas mitmed väikesed nsp-d, mis vabanevad pp1a karboksüterminaalsest (C-terminaalsest) piirkonnast Mpro-st allavoolu (vastavalt koroonaviiruse nsp5 ja arteriaalse viiruse nsp4).Neil on piiratud perepõhine kaitse ja mitmekesised tegevused (vaadatud viites 10âââ12).

Suhteliselt hiljuti leiti kõigis pesastatud viirustes RdRp-ga külgnevast aminootsast (N-otsast) ainulaadsete järjestuste motiivi omadustega domeen, kuid mitte ühtegi teist RNA viirust (16).Selle asukoha ja nukleotiidtransferaasi (nukleosiidmonofosfaat [NMP] transferaasi) aktiivsuse põhjal nimetatakse seda domeeni NiRAN-iks (Nestvirus RdRp-ga seotud nukleotiidtransferaas).NiRAN-RdRp kahedomeeniline kombinatsioon moodustab nsp12 perekonnas Coronaviridae ja nsp9 perekonnas Arterioviridae ning teiste nestoviridae puhul eeldatakse, et NiRAN-RdRp vabaneb iseseisva nsp-na viiruse polüproteiinist.Koroonaviiruses sisaldab NiRAN-i domeen A1/450 jääki ja on linkerpiirkonna (16-19) kaudu ühendatud C-terminaalse RdRp domeeniga.Hobuste arteriidiviiruse (EAV) (Arteriviridae) korral näitab rekombinantne nsp9 Mn2+ ioonist sõltuvat (ise) UMPülatsiooni ja GMPülatsiooni aktiivsust, mis sõltuvad kolmest konserveerunud järjestuse alusest nestoviiruses, AN, BN ja CN. Järjestuse jäägid.Kus N tähistab NiRAN) (16).Nende motiivide N-terminaalne külgnemine on vähem konservatiivne motiiv preAN.Mõned neist jääkidest on konserveerunud ka kaugelt seotud proteiinkinaasides, kus on näidatud, et nad osalevad nukleosiidtrifosfaadi (NTP) seondumises ja katalüütilises aktiivsuses (20, 21).Kooskõlas selle tähelepanekuga saab Pseudomonas syringae pseudokinaasi SelO mitu peamist aktiivse saidi jääki kokku panna hiljuti avaldatud SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleksiga.Konserveeritud koroonaviiruse NiRAN-jäägid asetsevad elektronide mikrostruktuuris.Rekombinantne valk (17).Spekuleeritakse, et dokumenteeritud (ise) U/GMPüleerimine tekitab mööduva oleku NMP ülekandmiseks (praegu teadmata) substraadile (16) ning NiRANi ja proteiinkinaasi struktuurne sarnasus (17, 19) ) Kas hüpotees NiRAN muudab teisi valke.

Paljud funktsioonid, sealhulgas selle ainulaadne ja ainulaadne süstemaatiline seos pesastatud viirustega ja geneetiline eraldamine RdRp-st, muudavad NiRANi pesastatud viiruste jaoks mõistlikuks võtmereguleerivaks ensüümiks, mis on nende tekkimise ja identiteedi jaoks kriitiline.Varem kutsuti välja kolm võimalikku funktsiooni, mis hõlmasid NiRAN-i genoomi / subgenoomse translatsiooni või replikatsiooni / transkriptsiooni reguleerimiseks.Arvestades sel ajal saadaolevaid nappe ja mittetäielikke andmeid, on igal funktsioonil oma eelised ja puudused (16).Selle uuringu eesmärk on ühendada kahte perekonda esindavate koroonaviiruste biokeemilised ja pöördgeneetilised uuringud ning asetada oma leiud koroonaviiruste perekonna loomuliku mutatsiooni evolutsioonilisele taustale, et saada ülevaade sellest salapärasest sfäärist.Teatame suurtest edusammudest NiRAN-i mõistmisel looduslike sihtmärkide tuvastamise kaudu RTC-s, mis (kolme olemasoleva hüpoteesi hulgas) aitab kaasa selle domeeni rollile pesastatud viiruse RNA sünteesi algatamisel.See uuring avab ka võimalused NiRAN-i muudeks rollideks viiruse hosti liideses.

Koroonaviiruse nsp12-ga seotud NiRAN-domeeni ensümaatiliste omaduste iseloomustamiseks valmistasime E. coli-s inimese koronaviiruse 229E (HCoV-229E) nsp12 rekombinantse vormi, mille C-otsas oli His6 märgis, ja kombineerisime valk [α32-P]-ga Inkubeerige koos NTP-ga MnCl2 juuresolekul, nagu on kirjeldatud jaotises Materjalid ja meetodid.Reaktsiooniprodukti analüüs näitas radiomärgistatud valgu olemasolu, mis migreerub koos nsp12-ga (106 kDa), mis näitab, et koroonaviirus nsp12 katalüüsib kovalentsete valk-NMP aduktide moodustumist, mis moodustuvad eelistatavalt uridiinmonofosfaadiga (UMP) (joonis 1A). B).Kvantitatiivne analüüs näitas, et võrreldes teiste nukleotiididega suurenes UMP inkorporeerimise signaali intensiivsus 2–3 korda (joonis 1C).Need andmed on kooskõlas koroonaviiruse NiRAN domeeni prognoositava NMP transferaasi aktiivsusega (16), kuid näitavad, et koroonaviiruse ja arteriaalse viiruse NiRAN domeeni nukleotiidieelistused on erinevad.

HCoV-229E nsp12 enese-NMPülatsiooni aktiivsus.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) inkubeeriti määratud [a-32P] NTP-ga 6 mM MnCl2 juuresolekul 30 minutit (üksikasju vt materjalidest ja meetoditest).Reaktsiooniproduktid eraldati SDS-PAGE abil ja värviti Coomassie briljantsinisega.(B) Radioaktiivselt märgistatud valk visualiseeritakse fosforpildiga.Nsp12-His6 ja valgu molekulmassi markerite asukohad (kilodaltonites) on näidatud joonistel A ja B. (C) Radioaktiivse signaali intensiivsus (keskmine ± SEM) määrati kolme sõltumatu katse põhjal.*P≤0,05.Signaali tugevus (protsent) on seotud UTP-ga.

Kuigi on näidatud, et NiRAN-iga seotud ensüümi aktiivsus on oluline EAV ja SARS-CoV replikatsiooniks rakukultuuris (16), ei ole NiRAN-i spetsiifilist funktsiooni ja potentsiaalseid sihtmärke veel kindlaks tehtud.Hiljuti teatatud struktuurne sarnasus NiRANi ja proteiinkinaasitaoliste voldikutega valkude perekonna vahel (17, 22) ajendas meid testima hüpoteesi, et NiRAN katalüüsib teiste valkude NMPülatsiooni.Lõime potentsiaalsete homoloogsete sihtmärkide komplekti, sealhulgas HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) kodeeritud mittestruktuursed valgud, millest igaüks sisaldab C-terminaalset His6 märgist (SI lisa, tabel S1) ja inkubeerige neid valke [α32-P] uridiintrifosfaadiga ([α32-P]UTP) nsp12 juuresolekul või puudumisel.Veise seerumi albumiin ja E. coli-s toodetud MBP-LacZα liitvalk toimisid kontrollidena (joonis 2A, rajad 1 kuni 7).Radioaktiivselt märgistatud valku analüüsiti naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi (SDS-PAGE) ja autoradiograafiaga ning leiti, et nsp12 ja nsp9 sisaldavas reaktsioonis oli tugev radioaktiivne signaal.Signaali asukoht vastab nsp9 molekulmassile, mis näitab nsp9 nsp12-vahendatud UMPülatsiooni (joonis 2B, rada 7).Ühtegi teist testvalku ei leitud UMPüleerituna, mistõttu jõudsime järeldusele, et nsp9 on nsp12 spetsiifiline substraat.Kooskõlas joonisel 1 näidatud ise-NMPülatsiooni andmetega on nsp12 võimeline üle kandma kõik neli NMP-d nsp9-sse, kuigi tõhusus on erinev, UMP> adenosiinmonofosfaat (AMP)> guanosiinmonofosfaat (GMP)> tsütidiinimonofosfaat (CMP)) ( Pilt).3 A ja B).Selles testis kasutatud tingimustes (reaktsiooni- ja kokkupuuteaja lühendamine, nsp12 kontsentratsiooni vähendamine; materjalid ja meetodid) ei olnud võimalik nsp12 enese-NMPülatsiooni tuvastada (vrd joonis 2B, rada 7 ja joonis 1B), mis osutus tõhusaks (ja mitu ringi) UMP kolis nsp12-lt nsp9-le.UMP transferaasi aktiivsus eeldab Mn2+ ioonide olemasolu, nagu on näidatud joonisel 3C, samas kui Mg2+ juuresolekul täheldati ainult minimaalset UMP transferaasi aktiivsust ja kahe teise testitud kahevalentse katiooni juuresolekul aktiivsust ei täheldatud.Sarnased andmed saadi NMPülatsiooni testides, mis sisaldasid tsütidiintrifosfaati (CTP), guanosiintrifosfaati (GTP) ja adenosiintrifosfaati (ATP) (SI lisa, joonis S1).

HCoV-229E nsp12-vahendatud nsp9 UMPülatsioon.HCoV-229E nsp12-His6⁺-vahendatud UMPülatsiooni aktiivsuse hindamiseks kasutati rida valgu substraate (sealhulgas veise seerumi albumiin, MBP-lacZα ja rida HCoV-229E nsps-sid, mis olid märgistatud ORF1a poolt kodeeritud C-terminaalse His6-ga) valk.Inkubeerige valku [α-32P] UTP-ga 10 minutit nsp12 puudumisel (A) või juuresolekul (B), nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites.A ja B ülaosas on Coomassie Brilliant Blue värvitud SDS-polüakrüülamiidgeel ning A ja B allosas vastavad autoradiogrammid.Valgu molekulmassi markeri asukoht (kilodaltonites) on toodud vasakul.Samuti on näidatud nsp12-His6 asukoht (B, ülemine) ja radioaktiivne signaal, mida täheldati nsp12-His6 inkubeerimisel nsp9-His6-ga (B, rada 7), mis näitab, et [α-32P]UMP nsp9-His6-ks (12,9 kDa), mida teiste testitud valkude puhul ei täheldatud.

HCoV-229E NiRAN-vahendatud nsp9 NMPülatsiooni biokeemiline ja viroloogiline iseloomustus.(A ja B) Reaktsioonis kasutatud nukleotiidi kaassubstraadi roll.Nsp12-His6 ja nsp9-His6 segatakse ja inkubeeritakse standardses NMPülatsiooni testis erinevate [α-32P] NTP-de juuresolekul.(A, ülemine) Coomassie-värvitud nsp9-His6, eraldatud SDS-PAGE abil.(A, alumine) Geeli sama ala autoradiograaf.(B) Suhteline aktiivsus (keskmine ± SEM) määratud nukleotiidi kofaktori juuresolekul määratakse kolme sõltumatu katse põhjal.*P≤0,05.(C) Metalliioonide roll.Näidatud on standardne NMPülatsiooni test [α-32P] UTP ja erinevate metalliioonide juuresolekul, millest igaühe kontsentratsioon on 1 mM.C-s on näidatud ülemine, Coomassie värvitud nsp9-His6 ja C-s alumine vastav autoradiograafia.Märgistatud valgu suurus (kilodaltonites) on näidatud A-st ja C-st vasakul. (D) HCoV-229E nsp12-His6 mutantne vorm, mis kannab määratud aminohappe asendust, on [α-32P]UTP-s, nagu on kirjeldatud. materjalid ja meetodid.NMPüleerimisreaktsioonis toodetud radioaktiivselt märgistatud nsp9-His6 tuvastatakse fosforüülimise kujutisega (D, ülemine).Suhteline aktiivsus võrreldes metsiktüüpi (wt) valguga on näidatud D-s ja põhja on võetud kolme sõltumatu katse keskmine (± SEM).Tärnid tähistavad mittekonserveerunud jääkide asendusi.(E) Viiruse tiiter p1-rakkude kultuuri supernatandis, mis saadi 24 tundi pärast nakatamist, määrati naastude analüüsiga.On näidatud koodoni asendused konstrueeritud HCoV-229E mutandi NiRAN domeenis (jääkide nummerdamine põhineb nende asukohal pp1ab-s).Kontrollina kasutati replikatsioonipuudulikku RdRp aktiivse saidi mutanti nsp12_DD4823/4AA.

NiRANi aktiivse saidi sügavamaks mõistmiseks ja nsp9-spetsiifilise NMP transferaasi aktiivsusega seotud jääkide määramiseks teostasime mutatsioonianalüüsi, milles asendasime NiRAN AN, BN ja CN motiivides konservatiivsed jäägid ( 16) See on Ala (SI lisa, joonis S2).Lisaks hinnati kahel juhul konservatiivsete Arg-to-Lys või Lys-to-Arg asenduste mõju.(Negatiivse) kontrollina asendatakse koronaviiruste ja teiste pesastatud viiruste NiRAN-i domeenis mittekonserveeritud või vähem konserveerunud jäägid Ala-ga. Asendab K4116A (motiivil preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiiv). BN) ja D4280A (CN) vähendavad oluliselt või isegi kõrvaldavad nsp9 NMPülatsiooni nsp12 kaudu, samas kui konservatiivsete asendustega valgud (R4178K) , K4116R säilitavad 60% ja 80% oma aktiivsusest, mis näitab, et piirangute leevendamine nende vastaval poolel ahelad on füüsikalis-keemiliselt tundlik (joonis 3D).Mitmete teiste konserveeritud jääkide E4145A, D4273A, F4281A ja D4283A asendamine on palju vähem kahjulik ning nsp9 UMPüleerimine väheneb vaid mõõdukalt.Sarnased tulemused saadi nsp9 NMPüleerimisreaktsioonides, mis hõlmasid teisi NTP-sid (joonis 3D ja SI lisa, joonis S3), kinnitades, et täheldatud mõjud spetsiifilistele aminohapete asendustele ei sõltu kasutatud nukleotiidi kaassubstraadi tüübist.Järgmisena testisime nende nsp12 asenduste võimalikku mõju koronaviiruste replikatsioonile rakukultuuris.Selleks kasutasime 5–7 rakkude transkribeerimiseks sobivaid geneetiliselt muundatud komplementaarse DNA (cDNA) malle, mis olid kloonitud rekombinantsesse vaktsiiniaviirusesse (23, 24).Nendes rakkudes toodetud nakkusliku viiruse järglaste tiitrimine näitas, et enamik HCoV-229E NiRAN-i mutante ei olnud teostatavad (joonis 3E).Mitteelujõuliste viirusmutantide rühm sisaldab alternatiive, mis on näidanud, et need kõrvaldavad või vähendavad oluliselt NMP transferaasi aktiivsust in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), kuid on veel kaks alternatiivi (K4116R, E4145A). % broneeritud?Nende in vitro NMPülatsiooni aktiivsus viitab täiendavate piirangute olemasolule.Samamoodi tekitasid kaks muud mutatsiooni (R4178K, F4281A), mis põhjustasid NiRANi in vitro NMPülatsiooni aktiivsuse mõõduka vähenemise, elusaid viirusi, kuid need viirused vähendasid oluliselt tiitreid replikatsiooni kaudu.Kooskõlas joonisel 3D näidatud in vitro aktiivsuse andmetega, asendades neli muud jääki, mis ei ole koronaviiruses ja/või teistes pesastatud viirustes (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) konserveerunud, tekitasid elujõulisi viirusi. metsikut tüüpi viirusega võrreldes mõõdukalt vähenenud tiiter (joonis 3E).

Selleks et uurida, kas NiRAN-vahendatud NMP transferaasi aktiivsus sõltub aktiivsest RdRp domeenist, asendati kaks konserveerunud Asp jääki, mis osalesid kahevalentse metalliioonide (11) koordineerimises RdRp motiivis C, Ala-ga. Saadud valk nsp12_DD4823/4AA säilib. selle nsp9 NMPülatsiooni aktiivsus, mis näitab, et nsp12-vahendatud in vitro nsp9 NMPülatsiooni aktiivsus ei vaja polümeraasi aktiivsust (SI lisa, joonis S4).

Pärast nsp9-spetsiifilise NMP transferaasi aktiivsuse kindlakstegemist nsp12 jaoks püüdsime iseloomustada NMP-nsp9 adukti massispektromeetria (MS) abil.Rekombinantse HCoV-229E nsp9 täielik valgu massispekter näitas piiki 12 045 Da juures (joonis 4A).Nsp12 lisamine ei muutnud nsp9 kvaliteeti, mis näitab, et nsp12 ja nsp9 ei moodusta kasutatud tingimustes (denatureerimine) stabiilset kompleksi (joonis 4A).UTP ja GTP juuresolekul näitas nsp9 ja nsp12 sisaldava reaktsiooni massi mõõtmine, et UTP valgu mass liikus 306 Da ja GTP valgu mass liikus 345 Da, mis näitab, et iga nsp9 molekul seob UMP või GMP. (Pilt 4) C ja D).Spekuleeritakse, et NiRAN-vahendatud nsp9 NMPüleerimiseks vajalik energia pärineb NTP hüdrolüüsist ja pürofosfaadi vabanemisest.Kuigi selles reaktsioonis kasutati nsp9 (sihtmärk) 10-kordset molaarset liia kui nsp12 (ensüüm), täheldati nsp9 peaaegu täielikku NMPülatsiooni, mis näitab, et nsp12 ja nsp9 vaheline interaktsioon on lühiajaline ja nsp12 suudab NMPüleerida rohkem nsp9. in vitro molekul.

Nsp9 üksik NMPüleerimine nsp12 ja UTP või GTP juuresolekul.Näidatud on HCoV-229E nsp9 dekonvoluteeritud täielik valgu massispekter (SI lisa, tabel S1) (AD).(A) nsp9 üksi, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP juuresolekul, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP juuresolekul.

Nsp12 poolt UMPüleeritud nsp9 jääkide määramiseks lõhustati nsp9-UMP trüpsiiniga.Saadud peptiidid eraldati nano-kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil ja analüüsiti tandem-massispektromeetria (MS/MS) abil võrgus.Andmete analüüs Byonicu tarkvarapaketiga (Protein Metrics) näitas N-terminaalse aminohappe UMPülatsiooni.See kinnitatakse käsitsi.Prekursorpeptiidi [UMP]NNEIMPGK tandem-massispekter (SI lisa, joonis S5A) näitas fragmendi sagedusel 421 m/z, mis näitab, et UMP seondub nsp9 jäägiga 1.

Nsp9 N-otsas on Asn Orthocoronavirinae liikmete seas konserveerunud (SI lisa, joonis S6).Kuigi usume, et N-terminaalne primaarne amiini lämmastik on UMP kõige tõenäolisem aktseptor, otsustasime hankida täiendavaid tõendeid NMP seondumise kohta N-otsas.Sel põhjusel saadi HPLC-ga puhastatud NMPüleerimata ja NMPüleeritud N-terminaalne peptiid nsp9 atsetooni ja naatriumtsüanoboorhüdriidi juuresolekul.Nendes tingimustes saab propüüliga (25) modifitseerida ainult vabu primaarseid amiine.N-terminaalne nsp9-st tuletatud peptiid järjestusega NNEIMPGK sisaldab kahte primaarset amiini, millest üks on Asn N-otsas ja teine ​​Lys-i kõrvalahelas C-otsas.Seetõttu võib propüülrühmi sisestada mõlemas otsas.NMPüleerimata peptiidide ekstraheeritud ioonkromatogrammid on näidatud SI lisas, joonisel S5B.Ootuspäraselt saab identifitseerida N-otsa ja C-otsa (mono)propüülitud (SI lisa, joonis S5B, ülemine rada) ja dipropüülitud peptiide (SI lisa, joonis S5B, alumine rada).See muster muutub nsp9 NMPüleeritud N-terminaalse peptiidi kasutamisel.Sel juhul saab tuvastada ainult C-otsa propüülitud peptiide, kuid N-otsa propüülitud peptiide ja dipropüülitud peptiide ei tuvastata (SI lisa, joonis S5C), mis näitab, et UMP on üle kantud N-terminaalsesse primaarsesse amiini Selle vältimiseks grupp muudatusi tegemast.

Järgmisena asendame (Ala või Ser-iga) või kustutame nsp9 N-otsas olevad konserveerunud jäägid, et määratleda sihtmärgispetsiifilised piirangud.Tuginedes meie MS andmetele, mis näitavad, et NiRAN moodustab nsp9 N-terminaalse jäägi primaarse amiiniga nsp9-NMP adukti, püstitasime hüpoteesi, et nsp9 NMPüleerimiseks on vaja viiruse peaproteaasi (Mpro, nsp5), et vabastada nsp9 N-terminaal. selle polüproteiini eelkäija.Selle hüpoteesi kontrollimiseks tootsime E. colis nsp9-d sisaldava prekursorvalgu nsp7-11 ja viisime läbi standardse NMPülatsiooni testi [α-32P] UTP juuresolekul (materjalid ja meetodid).Nagu on näidatud joonisel 5A (rada 3), ei ole lõikamata nsp7-11 prekursor nsp12-ga radiomärgistatud.Seevastu kui nsp7-11 lõhustatakse rekombinantse nsp5 poolt, et vabastada nsp9 (ja teised nsp-d) prekursorist, tuvastatakse radiomärgistatud valk, mis migreerub koos nsp9-ga, mis kinnitab meie järeldust, et NiRAN ja N-selektiivsed kovalentsete nsp9-NMP aduktide moodustumine. .N-terminaalse Asn terminaalne primaarne amiin (positsioon 3825 pp1a/pp1ab-s).Seda järeldust toetavad ka katsed, milles kasutati nsp9 konstrukti, mis sisaldab N-otsas ühte või kahte täiendavat jääki.Mõlemal juhul kaotati nsp9 NiRAN-vahendatud UMPüleerimine (SI lisa, joonis S7).Järgmisena tootsime valgu, mille nsp9 N-otsas oli 3825-NNEIMPK-3832 peptiidijärjestusest kustutatud üks või kaks Asn jääki.Mõlemal juhul blokeeriti nsp9 UMPüleerimine täielikult (joonis 5B), mis annab täiendavaid tõendeid selle kohta, et tegelik nsp9 N-ots toimib NMP retseptorina.

Nsp9 proteolüütiline töötlemine ja N-terminaalsete jääkide roll nsp12-vahendatud UMPülatsioonis.(A) nsp9 UMPüleerimine nõuab vaba nsp9 N-terminali.Nsp7-11-His6 eelinkubeeritakse 30 °C juures NMPülatsiooni tuvastamise puhvris, mis sisaldab UTP-d rekombinantse Mpro (nsp5-His6) juuresolekul või puudumisel.3 tunni pärast alustage NMPülatsiooni testi, lisades nsp12-His6, nagu on kirjeldatud jaotises Materjalid ja meetodid.Kontrollina kasutati reaktsiooni, mis sisaldas nsp5-His6 (rada 1) ja nsp9-His6 (rada 2).10 minuti pärast reaktsioon peatati ja reaktsioonisegu eraldati SDS-PAGE abil.Valk värviti Coomassie Brilliant Blue värviga (A, ülemine).Paremal on näidatud Nsp7-11-His6 prekursor ja nsp5-His6 vahendatud lõhustamise tulemusena saadud töödeldud saadus.Pange tähele (nende väiksuse tõttu), et nsp7 ja nsp11-His6 ei ole selles geelis tuvastatavad ning reaktsioonile lisatakse nsp5-His6 (rajad 1 ja 4; nsp5-His6 asukoht on tähistatud tahke ringiga) või nsp9-His6 (rada 2) sisaldab väikest kogust MBP-d (tähistatud avatud ringidega) jääklisanditena, kuna neid ekspresseeritakse MBP sulandvalkudena (SI lisa, tabel S1).(B) Nsp9-His6 variandil puudub üks või kaks N-terminaalset Asn jääki (jääkide nummerdamine vastavalt positsioonile pp1a/pp1ab) ning see puhastatakse ja inkubeeritakse nsp12-His6 ja [α-32P] UTP-ga.B, Coomassie'ga värvitud SDS-PAGE on näidatud ülal, B, vastav autoradiograaf on näidatud all.Molekulmassi markeri asukoht (kilodaltonites) on näidatud vasakul.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminaalsed konserveerunud jäägid asendati Ala või Ser-iga ja nsp12-His6 vahendatud UMPülatsioonireaktsioonis kasutati sama kogust valku.Reaktsiooniproduktid eraldati SDS-PAGE abil ja värviti Coomassie Brilliant Blue'ga (C, ülemine) ja radioaktiivselt märgistatud nsp9-His6 tuvastati fosforestsentskujutise abil (C, keskmine).Kasutades metsiktüüpi (wt) valku võrdlusena (seadistatud 100%), arvutati suhteline NMPülatsiooni aktiivsus (keskmine ± SEM) kolme sõltumatu katse põhjal.(D) HCoV-229E metsiktüüpi Huh-7 rakkudega nakatunud Huh-7 rakkude ja nsp9-s määratud aminohappe asendusi kandvate mutantide viiruse tiitrid p1 rakukultuuri supernatandis määrati naastude testiga.Negatiivse kontrollina kasutati replikatsioonipuudulikku RdRp motiivi C topeltmutanti DD4823/4AA.

Nsp9 N-ots (eriti positsioonid 1, 2, 3 ja 6) on Orthocoronavirinae alamperekonna liikmete seas väga konserveerunud (SI lisa, joonis S6).Nende jääkide võimaliku rolli uurimiseks nsp12-vahendatud nsp9 NMPülatsioonis asendati kaks järjestikust Asn jääki nsp9 N-otsas Ala või Ser-iga (üksi või kombinatsioonis).Võrreldes metsiktüüpi nsp9-ga vähendas N3825 asendamine Ala või Ser-iga nsp12-vahendatud UMPülatsiooni enam kui kaks korda (joonis 5C).Kooskõlas meie järeldusega, et NMPüleerimine toimub N-otsa primaarses amiinis, mitte N-terminaalse jäägi külgahelas, täheldasime N3825A ja N3825S asendamisel olulist jääk-NMPülatsiooni.Huvitav on see, et kui teine ​​Asn asendatakse Ala või Ser-iga, väheneb nsp9 UMPülatsioon tugevamini (rohkem kui 10 korda), samas kui Ala asendamisel positsioonides 3, 4 ja 6 on nsp9 UMPülatsioonile ainult mõõdukas mõju (joonis 2). ) .5C).Sarnased tulemused saadi ATP, CTP või GTP abil (SI lisa, joonis S8).Need andmed näitavad ühiselt N2826 (nsp9 positsioon 2) võtmerolli nsp9 NMPülatsioonis.

Täiendavate tõendite saamiseks nsp9 N-otsa ja NMPülatsiooni vahelise funktsionaalse korrelatsiooni kohta viisime läbi koroonaviiruse perekonna nsp9 järjestuse mitme järjestuse joondamise (MSA) (muutes 104 ja 113 jäägi vahel) (SI lisa, joonis S6).Kokku leiti Orthocoronavirinae alamperekonna 5 perekonna 47 (tuntud ja oletatava) liigi puhul, mis nakatavad erinevaid imetajaid, linde ja roomajaid, kokku ainult 8 jääki, mis on muutumatud.Kõige ulatuslikumaid muutusi, sealhulgas deletsioone ja insertsioone, täheldati nsp9 sekundaarse struktuuri elementide vahelistes tsüklites, nagu on kindlaks tehtud varasemate struktuuriuuringutega (26 ± 28).Nsp9 C-terminaalse osa β-ahelas ja α-heeliksis leiti viis muutumatut jääki.Kolm muutumatut jääki moodustavad nsp9 N-otsa NNE-motiivi.Selgub, et selle motiivi teine ​​Asn on ainus muutumatu jääk, mida jagab ka kaugelt suguluses oleva konnakoroonaviiruse hüpoteetiline nsp9 ja mis esindab Microhyla letovirus 1 liiki Alphaletovirus Letovirinae alamperekonnas.Nsp9 sekundaarse struktuuri elementide jääkide säilimist saab struktuuriliste kaalutluste abil ratsionaliseerida, et säilitada voltimis- või teadaolevad RNA sidumisomadused.Kuid see arutluskäik ei tundu kehtivat NNE säilitamise kohta ja enne seda uuringut oli tripeptiidjärjestuse varieerumist piiravate piirangute olemus täielikult varjatud.

Selleks, et teha kindlaks nsp9-NMPülatsiooni ja NNE konserveerimise tähtsus koroonaviiruse replikatsioonis, valmistasime HCoV-229E mutandid, mis kannavad nsp9 N-terminaalsete jääkide ühe- või kahekordseid asendusi, mis näitab, et nsp9 NMPüleerimine on in vitro kahjulik.Enne alustamist proovime vastata küsimusele, kas need asendused (nsp8|9 lõhustamiskoha lähedal) mõjutavad C-terminaalse pp1a piirkonna proteolüütilist töötlemist.nsp7-11 polüproteiini konstruktide komplekt, mis sisaldas vastavaid asendusi nsp9 N-otsas, valmistati E. coli-s ja lõigati rekombinantse Mpro-ga.Nelja saidi (sealhulgas nsp9 külgneva saidi) proteolüütilist lõhustamist ei mõjuta oluliselt sisseviidud asendused (SI-lisa, joonis S9), välja arvatud nende valkude struktuursed muutused, mis häirivad Mpro-vahendatud nsp8|9 lõhustamist (või muud). veebisait.

Huh-7 rakud transfekteeriti genoomi pikkuse HCoV-229E RNA-ga, mis kodeeris Ala või Ser asendusi konserveerunud NNE tripeptiidides (N3825, N3826 ja E3827) nsp9 N otsas, mis näitab, et enamik mutatsioone on surmavad.Suutsime viiruse päästa, asendades N-terminaalse Asn (N2835A või N2835S) Ser või Ala, kuid ei suutnud viirust taastada koos teiste NNE järjestuse ühe- ja topeltmutatsioonidega (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (joonis 5D).

Need tulemused näitavad, et koronaviiruste replikatsioon koekultuuris on piiratud (sama või sarnane), piirates nsp9 NMPülatsioonisaitide loomulikku mutatsiooni kehas ja toetades selle vastuse võtmerolli koroonaviiruste elutsüklis.

Viimases katsekomplektis tootsime E. coli-s C-terminaalse His6 märgistatud SARS-CoV-2 nsp12 ja nsp9 ning nsp12 kaks mutantset vormi.Aktiivse saidi jäägid NiRAN ja RdRp domeenides olid vastavalt Kasutage Ala (joonis 6A ja SI lisa, tabel S2).K4465 SARS-CoV-2 nsp12-s vastab K4135-le HCoV-229E-s (SI lisa, joonis S2), mis osutus vajalikuks NiRAN-i aktiivsuse ja HCoV-229E replikatsiooni jaoks (joonis 3D ja E).See jääk vastab ka arteriaalse viiruse EAV nsp9 K94 jäägile, mis varem näidati olevat vajalik NiRAN-i enese-UMPüülimiseks/self-GMPüleerimiseks (16).Nagu on näidatud joonisel fig 6B, on SARS-CoV-2 nsp12-l UMP transferaasi aktiivsus, kasutades substraadina nsp9, samas kui nsp12_K4465A aktiivse saidi mutant on inaktiivne.Kahekordne asendus RdRp motiivi C SDD iseloomulikus järjestuses ei mõjuta UMP transferaasi aktiivsust (joonis 6B), mis näitab, et RdRp aktiivsusel puudub otsene mõju nsp9 UMPülatsioonile.Sarnased andmed saadi CTP, GTP ja ATP abil (SI lisa, joonis S10).Kokkuvõttes näitavad need andmed, et NiRAN-vahendatud nsp9 NMPülatsioonil on konservatiivne aktiivsus koroonaviiruste puhul, mis esindavad ortokoronaviiruse alamperekonna erinevaid perekondi.

SARS-CoV-2 nsp12-vahendatud nsp9 NMPüleerimine.(A) Coomassie värvitud SDS-polüakrüülamiidgeel, mis näitab NMPülatsiooni testis kasutatud rekombinantset valku.Kontrollina kasutati SARS-CoV-2 nsp12 NiRAN domeenis (K4465A) ja RdRp domeenis (DD5152/3AA) aktiivse saidiga asendusega mutantset valku.Jääkide nummerdamine põhineb asukohal pp1ab-s.(B) UMPülatsiooni tuvastamise autoradiograaf, kasutades nsp9-His6 ja [α-32P]UTP substraadina nsp12-His6 (metsiktüüpi [wt] ja mutant).Märgistatud valgu molekulmass (kilodaltonites) on näidatud vasakul.

NiRAN-i domeenid on Nidoviralesis (16) üldiselt konserveerunud, mis näitab, et need katalüüsivad Nidoviiruse replikatsiooniks olulisi ensümaatilisi reaktsioone.Selles uuringus suutsime tõestada, et koroonaviiruse NiRAN-domeen kannab NMP-d (genereeritud NTP-st) nsp9-le, salapärasele RNA-d siduvale valgule, mis osaleb viiruse replikatsioonis (26-29), et määrata see loodusliku sihtmärgina ja koronaviiruse RTC partner.

NiRAN-i domeen jagab kolme järjestuse motiivi (AN, BN ja CN), mis sisaldavad väga väikest arvu jääke, mis on konserveeritud kõigis perekondades monofüleetilises, kuid väga diferentseeritud Nidovirales'i järjekorras (8, 16).Hiljutised uuringud on näidanud, et need on struktuurselt seotud suures osas iseloomustamata proteiinkinaasilaadsete valkude perekonnaga, mida algselt nimetati SelO perekonnaks (17, 19, 22, 30, 31).SelO-ga seotud valkudel on kinaasivoldid, kuid neil puuduvad klassikalistes kinaasides mitmed konserveerunud aktiivse saidi jäägid (22, 32).Tuginedes aktiivse saidiga seotud ja spetsiifiliste interaktsioonidega stabiliseeritud ATP molekulide vastupidisele orientatsioonile, püstitati SelO hüpotees ja seejärel kinnitati, et see kannab AMP (fosfaadi asemel) valgu substraadile (22), samal ajal kui teisel bakteriaalsel SelO-sarnasel valgul YdiU. hiljuti on näidatud, et see katalüüsib UMP kovalentset kinnitumist erinevate valgu substraatide Tyr ja His jääkidega (33).

Koronaviiruse NiRAN domeeni oletatavate aktiivse saidi jääkide prognoosi kinnitamiseks ja laiendamiseks kasutasime koroonaviiruse nsp12 mutatsioonianalüüsi läbiviimiseks biokeemilisi ja pöördgeneetika meetodeid (joonis 3D ja E ning SI lisa, joonis S3 ja tabel) S1â S4).Andmed näitavad, et HCoV-229E K4135, R4178 ja D4280 asendamine Alaga kõrvaldab in vitro NMP transferaasi aktiivsuse ja viiruse replikatsiooni rakukultuuris (joonis 3D ja E ning SI lisad, joonis S3), toetades nende esinemist NTP y-fosfaadis ( K4135, R4178) ja aktiivse saidi metalliioonide koordineerimine (D4280).Konserveeritud Glu asendus E4145A linnupesaviiruse piirkonnas, mis prognoositi stabiliseerivat K4135 (17) positsiooni, kõrvaldas viiruse replikatsiooni, kuid üllatuslikult säilis aktiivsus in vitro NMPülatsiooni testis (joonis 3D ja E ning SI lisa, joonis S3 ja tabelid S1–S4).Sarnane tähelepanek tehti ka siis, kui Salmonella typhimurium'i (E130A) YdiU homoloogis viidi sisse vastav asendus (33).Kokkuvõttes toetavad need andmed pigem selle konserveerunud jäägi regulatiivset funktsiooni kui katalüütilist funktsiooni.

Konserveerunud Phe jäägi (F4281A) asendamine nestoviiruse vahemikus HCoV-229E NiRAN domeenis (8) põhjustas NMPülatsiooni aktiivsuse vähenemise in vitro ja viiruse replikatsiooni olulise vähenemise rakukultuuris (joonis 3D, E ja SI) lisa, joonis S3).Andmed on kooskõlas selle jäägi olulise regulatiivse funktsiooniga, nagu eelnevalt näidatud homoloogse DFG motiivi Phe jääk.Klassikalistes proteiinkinaasides on see osa Mg2+ sidumisahelast ning aitab kokku panna ja reguleerida selgroogu???Nõutav tõhusa katalüütilise aktiivsuse jaoks (32, 34).Ala ja Arg asendamine K4116 jääkidega (preAN-motiivis) kõrvaldas viiruse replikatsiooni ja, nagu oodatud, avaldas see erinevat mõju NMP transferaasi aktiivsusele in vitro, sõltuvalt sisestatud aminohappe kõrvalahelast (joonis 3D ning E ja SI lisad , joonis S3).Funktsionaalsed andmed on kooskõlas struktuurse teabega, mis näitab, et see jääk on loonud koostoime ATP fosfaadiga (17).Teiste pesastatud viirusperekondade NiRAN-domeenis on HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 positsiooni hõivanud Lys, Arg või His (8), mis näitab, et selle spetsiifilise jäägi funktsionaalne piirang on leevendatud.D4188A ja D4283A asendamine kõrvaldab või vähendab tugevalt ensüümi aktiivsust ja kõrvaldab viiruse replikatsiooni (joonis 3).Need kaks jääki on enamikus (kuid mitte kõigis) pesastatud viirustes (8) konserveerunud, mis näitab olulist perekonnaspetsiifilist, kuid võib-olla mittekatalüütilist funktsiooni.Kontrollidena kasutati mitmete teiste Lys- ja Asp-jääkide (K4113A, D4180A, D4197A ja D4273A) Ala asendusi, mis ei ole Coronaviridae ega teistes Nestioviridae perekondades (8) konserveerunud.Nagu oodatud, on need asendused suures osas talutavad, ensüümi aktiivsuse ja viiruse replikatsiooni mõningatel juhtudel väheneb (joonis 3 ja SI lisa, joonis S3).Üldiselt on koronaviiruse mutageneesi andmed väga kooskõlas EAV NiRAN-RdRp (16) enese-GMP ja pöördgeneetika andmetega, milles EAV nsp9 (koronaviiruse nsp12 ortoloog) jääk K94 (vastab HCoV-229E K4135) täidab olulisi funktsioone. R124 (vastab R4178), D132 (vastab D4188), D165 (vastab D4280), F166 (vastab F4281).Lisaks on HCoV-229E mutageneesi andmed kooskõlas ja laiendatud varem teatatud SARS-CoV pöördgeneetika andmetele (16), mis on täpselt samasugused nagu vastava CN-motiivi Phe-to-Ala mutandi SARS-CoV_nsp12 puhul täheldatud andmetega. kirjeldatud fenotüüp -F219A ja HCoV-229E_F4281A (joonis 3 D ja E ning SI lisa, joonis S3 ja tabel S1-S4).

Võrreldes EAV ortoloogidega (16), mis eelistavad selgelt UTP-d ja GTP-d (ise-NMPüleerimisreaktsioonis), näitab meie uuring, et koroonaviiruse NiRAN-domeeni (mida esindavad HCoV-229E ja SARS-CoV-2) saab tõhusalt kasutada. üle Kõik neli NMP-d, kuigi UMP-d eelistatakse veidi (joonised 1 ja 3).Spetsiifilise NTP kaassubstraadi suhteliselt madal spetsiifilisus on kooskõlas hiljuti teatatud SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkomposiitstruktuuriga, milles ADP-Mg2+ seondub NiRANi aktiivse saidiga, kuid mitte adeniini osaga. spetsiifiliste interaktsioonide tekkest (17).Meie uuringus ei oma NMPüleerimisreaktsioonis kasutatud nukleotiidi tüüp mutantse valgu aktiivsusele erinevat mõju (SI lisa, joonis S3), mis näitab, et ükski neist jääkidest ei ole tihedalt seotud konkreetse nukleoaluse seondumisega.Koronaviiruste ja arteriaalsete viiruste NiRAN domeenides täheldatud erinevate NTP kaassubstraadi eelistuste struktuurset alust ja potentsiaalset bioloogilist tähtsust tuleb veel uurida;need võivad olla tõesed või olla tingitud nende vastavate uuringute piirangutest.Praegu ei saa välistada, et arteriaalse viiruse NiRAN domeeni potentsiaalsel NMPülaatori aktiivsusel (võrreldes eelnevalt iseloomustatud enese-NMPülatsiooni aktiivsusega) on erinev kaassubstraadi eelistus, võttes arvesse, et arteriaalse ja koroonaviiruse sarnasus on NiRAN-i domeen on täis.Järjestuspõhine võrdlus (16).Võrreldes pseudokinaasi SelO-ga, mis kasutab kofaktorina Mg2+, sõltub koroonaviiruse ja arteriaalse viiruse NiRAN aktiivsus Mn2+-st (16) (joonis 3C ja SI lisa, joonis S1).Mn2+-sõltuvus ja ilmselge UTP eelistus on valgu NMPülaatorite ebatavaline omadus ning see on alles hiljuti kinnitust leidnud Salmonella typhimurium'i YdiU valgus, mis katalüüsib ranget Mn2+-sõltuvat valgu chaperone UMPülatsiooni, et kaitsta rakke stressi induktsiooni eest Cell ATP pool ( 33).

Hiljuti kirjeldatud struktuurne sarnasus koroonaviiruse NiRAN domeeni ja raku proteiinkinaaside vahel (17, 19) pakub täiendavat tuge NiRANi võimele siduda kovalentselt NMP teiste valkudega, millest oleme selles uuringus teatanud.Me keskendusime oma võimalike NiRAN-i sihtmärkide otsimisel HCoV-229E ORF1a kodeeritud valkudele, mis teadaolevalt aitavad otseselt või kaudselt RTC ORF1b-kodeeritud replikaasi (12, 35).Meie katsed annavad veenvaid tõendeid nsp9 tõhusa ja spetsiifilise NMPüleerimise kohta (joonis 2).Kui sihtvalku kasutatakse molaarses liias, mis on 8–10 korda suurem kui ensüümi (nsp12) oma, kinnitatakse, et nsp9 on täielikult (mono)NMP-s (joonis 4).Jõudsime järeldusele, et nsp12 ja nsp9 vaheline interaktsioon on lühiajaline ega moodusta nsp9-ga stabiilset kompleksi (teiste RTC subühikute puudumisel).Seda järeldust toetavad SARS-CoV proteoomi valkude koostoimeuuringud (35).MS analüüs tuvastas nsp9 N-terminaalse jäägi primaarse amiini NMPülatsiooni saidina (SI lisa, joonis S5).Fosforamidaatsideme ja N-otsa aminorühma moodustumine eristab NiRAN-vahendatud NMPülatsiooni aktiivsust Pseudomonas syringae SelO-vahendatud AMPüleerimisreaktsioonist, mis katalüüsib O-seotud AMP moodustumist Ser, Thr või Tyr jääkide peptiidi aduktis ( 22) ja S. typhimurium YdiU moodustab O-seotud (Tyr-ga) ja N-seotud (His-iga) peptiid-UMP adukte.SelO valkude perekonna kohta saadaolev piiratud teave näitab, et selle suure valguperekonna liikmed erinevad peptiid-NMP aduktide moodustumisel suuresti.See on huvitav tähelepanek, mis väärib edasist uurimist.

Selles uuringus saadud andmed panid meid oletama, et nsp9 NMPüleerimine nõuab vaba N-otsa.Viiruse replikatsiooni kontekstis tagab selle nsp8|nsp9 töötlemiskoha proteolüütiline lõhustamine replikaasi polüproteiini pp1a, mida vahendavad Mpro ja pp1ab.Enamikus koroonaviirustes hõivab selle konkreetse saidi (HCoV-229E VKLQ|NNEI) ja kõigi teiste koronaviiruse Mpro lõhustumiskohtade vahel Asn (mitte mõne teise väikese jäägi, nagu Ala, Ser või Gly) P1â???Asukoht (36).Varasemates uuringutes saadud peptiidide lõhustamise andmed näitasid, et nsp8|nsp9 saidi lõhustamise efektiivsus oli madalam kui teistel saitidel, mis näitab, et 1) sellel spetsiifilisel saidil võib olla regulatiivne roll C-terminali õigeaegses koordineeritud töötlemises. pp1a piirkond või 2) a Spetsiaalse konserveerunud nsp9 N-otsa roll viiruse replikatsioonis (37).Meie andmed (joonis 5A) näitasid, et nsp12 tegi NMP-ga tõhusalt nsp9 rekombinantset vormi, mis kandis tegelikku N-terminaalset järjestust.N-terminaalne külgnev järjestus eemaldati faktori Xa (nsp9-His6; SI lisa, tabel S1) või Mpro-vahendatud lõhustamise (nsp7-11-His6; joonis 5A ja SI lisa, tabel S1) abil.Oluline on see, et lõikamata nsp9-d sisaldav prekursor nsp7-11-His6 näitas resistentsust nsp12 NMPüleerimise suhtes, mis on kooskõlas meie andmetega, mis näitab, et nsp9-NMP adukt moodustub N-terminaalse primaarse amiini kaudu (SI lisa, joonis S5) .NiRAN-i substraadi spetsiifilisuse sügavamaks mõistmiseks keskendusime seejärel nsp9 külgnevatele N-terminaalsetele jääkidele.Teiste valkude puudumisel on nad struktuurselt paindlikud, takistades nende tuvastamist nsp9 märgistamata kujul (26 28, 38), mis näitab nende piiratud loomulikku varieerumist. Selle põhjuseks on oluline järjestusspetsiifiline (mitte sekundaarse struktuuriga seotud) nsp9 N-terminaalse fragmendi funktsioon.Konserveerunud jääkide ala-asendused selles piirkonnas (joonised 5C ja D ning SI lisa, joonis S8) näitavad, et N3826 on nsp9 NMPülatsiooni jaoks in vitro hädavajalik, samas kui N3825A ja E3827A asendused põhjustavad NMPülatsiooni vähenemist, samas kui asendused M3829A ja P3830A seda ei tee. .Ilmselt mõjutab nsp9 NMPülatsiooni.Kuigi N-terminaalse Asn (N3825A, N3825S) asendamisel on nsp9 NMPülatsioonile ja viiruse replikatsioonile rakukultuuris ainult mõõdukas mõju (joonis 5C ja D), on Asn-i jäägijärjestuse deletsioon N-terminaalsest 3825-NN dipeptiidist. See on viirustele surmav, mis näitab, et N-otsas on vaja ühte Asn-i jääki enne teist jääki, eelistatavalt Asn-i, kuigi tundub, et sarnaste jääkide asendamine on osaliselt talutav (joonis 5B, C ja D).Me järeldame, et 3825-NN dipeptiid, eriti konserveerunud ja oluline N3826 jääk koronaviiruse vahemikus (SI lisa, joonis S6), tagab nsp9 N-otsa õige seondumise ja orientatsiooni NiRANi aktiivses kohas.

Ala (E3827A) asendamine kõigi alamperekondade konserveerunud Glu-ga säilitab nsp9 NMPülatsiooni in vitro, kuid on rakukultuuris viirustele surmav (joonis 5C ja D), mis näitab selle jäägi lisafunktsiooni, näiteks võtmeinteraktsioonides (NMPüleeritud või modifitseerimata). ) nsp9 N-ots ja muud viiruse replikatsiooniga seotud tegurid.Nsp9 mutatsioonid ei mõjutanud nsp9 ega ühegi külgneva nsp-i proteolüütilist protsessi (39) (SI lisa, joonis S9), mis näitab, et mitmete nsp9 mutatsioonide surmavad fenotüübid ei olnud põhjustatud C proteolüütilise protsessi terminaalse pp1a piirkonna düsregulatsioonist. .

Ülaltoodud andmed näitavad, et pärast nsp8|9 lõhustamiskoha Mpro-vahendatud töötlemist pp1a/pp1ab-s saab nsp9 N-otsa UMPüleerida (või osaliselt teise NMP-ga modifitseerida).Lisaks viis nsp9 N-otsa suurepärane säilivus (sealhulgas ainsuse ja muutumatud Asn jäägid koroonaviiruse perekonnas) ja selles uuringus saadud pöördgeneetika andmed (joonised 3E ja 5D) järeldusele, et kirjeldatud nsp9 NMPülatsioon on bioloogiliselt seotud ja koronaviiruse replikatsiooniks hädavajalik.Selle modifikatsiooni funktsionaalseid tagajärgi tuleb veel uurida, näiteks seoses eelnevalt kirjeldatud (mittespetsiifilise) nsp9 (modifitseerimata vorm) RNA sidumisaktiivsusega (2628).N-terminaalne NMPüleerimine võib samuti mõjutada nsp9 interaktsiooni valgu või RNA substraatidega või erinevate neljatasandiliste koostude moodustumist.Neid on täheldatud struktuuriuuringutes ja on kinnitatud, et need on funktsionaalselt seotud koroonaviiruse replikatsiooniga, kuigi eriti selle modifikatsiooni puudumisel (26–29, 40).

Kuigi koroonaviiruse NiRAN domeeni sihtmärk-spetsiifilisust tuleb veel üksikasjalikumalt iseloomustada, näitavad meie andmed, et koroonaviiruse NiRAN domeeni valgu sihtspetsiifilisus on väga kitsas.Ehkki kõigi nidoviiruse perekondade NiRAN-domeenis põhiliste aktiivse saidi jääkide (8, 16) säilimine toetab tugevalt nende valkude konserveerunud NMPülaatori aktiivsust, on selle domeeni substraati siduvate taskujääkide identsus Säilivus ja säilimine veel iseloomustamata ja võivad erineda Nidovirales'i eesmärkide erinevate perekondade vahel.Samamoodi ei ole teiste pesastatud viiruste asjakohased sihtmärgid veel kindlaks määratud.Need võivad olla nsp9 või muude valkude kaugortoloogid, kuna järjestused väljaspool viit replikaasi domeeni, mis on tavaliselt pesastatud viirustes konserveerunud, on vähem konserveerunud (8), sealhulgas Mpro ja NiRANi vaheline genoomi massiiv. Nende hulgas asub nsp9 koroona viirus.

Lisaks ei saa me praegu välistada võimalust, et NiRAN-i domeenil on täiendavaid (sh rakupõhiseid) sihtmärke.Sel juhul tasub mainida, et selle esilekerkiva valgu NMPülaatorite (NMPylators) (30, 31) bakteriaalsetel homoloogidel näivad olevat "pearegulaatorid"?NMP moduleerib mitmesuguseid raku valke, et reguleerida või kõrvaldada nende allavoolu tegevusi, mängides seeläbi rolli mitmesugustes bioloogilistes protsessides, nagu rakuline stressireaktsioon ja redoks-homöostaas (22, 33).

Selles uuringus (joonised 2 ja 4 ning SI lisa, joonised S3 ja S5) suutsime tõestada, et nsp12 viis UMP (NMP) osa nsp9-s ühte (konserveeritud) positsiooni, samas kui teisi valke nsp9-s ei muudetud. kasutatud Tingimustes toetatakse hästi määratletud (mitte lahtist) substraadi spetsiifilisust.Kooskõlas sellega, võrreldes N-terminaalse nsp9 NMPülatsiooniga, on nsp12 enda NMPülatsiooni aktiivsus väga madal, selle tuvastamine nõuab pikemat autoradiograafia ekspositsiooniaega ja kasutatakse nsp12 kontsentratsiooni 10-kordset suurenemist.Lisaks ei suutnud meie MS analüüs anda tõendeid nsp12 NMPüleerimise kohta, mis viitab sellele, et NiRAN domeeni ise-NMPüleerimine on (parimal juhul) sekundaarne tegevus.Siiski tuleb märkida, et teised uuringud on andnud esialgseid tõendeid selle kohta, et bakteriaalse NMPülaatori enese-AMPülatsiooni staatus võib kontrollida nende NMPülatsiooni aktiivsust teistel valgu substraatidel (22, 33).Seetõttu on vaja rohkem uuringuid, et uurida EAV nsp9 (16) ja koronaviiruse nsp12 (käesolev uuring) kohta teatatud enese-NMPülatsiooni aktiivsuste võimalikke funktsionaalseid mõjusid, sealhulgas kavandatud chaperone-sarnast mõju C-terminaalse RdRp domeeni voltimisele ( 16) ).

Varem on kaalutud mitmeid hüpoteese nidoviiruse NiRAN domeeni võimalike allavoolu funktsioonide kohta, sealhulgas RNA ligaasi, RNA-ga kaetud guanülaadi transferaasi ja valgu praimimisaktiivsust (16), kuid ükski neist ei ühildu saadaolevate allavoolu funktsioonidega.Järgmistel positsioonidel saadud teave on täpselt sama aeg ilma täiendavaid eeldusi tegemata.Selles uuringus saadud andmed on kõige paremini kooskõlas (kuid ei saa tõestada), et NiRAN-i domeen osaleb valgu poolt indutseeritud RNA sünteesi algatamises.Varem arvati, et NiRAN-i domeeni funktsioon 5??Need ja muude andmete tugi ei mõjuta ²-RNA piiramise või RNA ligeerimise reaktsioone.Seetõttu arvatakse, et näiteks NiRAN-i aktiivne sait hõlmab konserveerunud Asp-i üldise alusena (D252 Pseudomonas syringae SelO-s; D4271 HCoV-229E pp1ab-s; D208 SARS-CoV-2 nsp12-s) (SI lisa, joonis 2) ).S2) (17, 22, 33), samas kui ATP-sõltuva RNA ligaasi ja RNA-d piirava ensüümi katalüüsi teostab kovalentne ensüüm-(lüsüül-N)-NMP vaheühend, mis hõlmab muutmata Lys-i jääki ( 41).Lisaks on koroonaviiruse NiRANi tähelepanuväärne järjestuspõhine spetsiifilisus konserveerunud valgu sihtmärkide suhtes ja NTP kaassubstraatide lõdvestunud spetsiifilisus (eelistab UTP-d) NiRAN-i vahendatud piirava ensüümi või RNA ligaasitaoliste funktsioonide vastu.

Ilmselt on nsp9-UMP (nsp9-NMP) võimaliku rolli kontrollimiseks valgu poolt indutseeritud RNA sünteesis kontrollimiseks ja, kui see on tõestatud, täpsustamiseks vaja teha palju lisatööd, mis ühendab mitu huvitavat, kuid (seni) varem teatatud aruannet. .Üksikud tähelepanekud.Näiteks on kindlaks tehtud, et koronaviiruse negatiivse ahelaga RNA ots algab oligo(U) ahelaga (42, 43).See tähelepanek on kooskõlas ideega, et negatiivse ahelaga RNA süntees käivitatakse nsp9 UMPüleeritud vormi sidumisel polü(A) sabaga (päästikud), mida võib soodustada selle RNA sidumine. Aktiivsus ja/või interaktsioon teine ​​RTC valk.Nsp9 pakutavat UMP osa saab seejärel kasutada "praimerina" nsp7/8/nsp12-vahendatud oligouridüülimisel, kasutades genoomse RNA 3??²-polü(A) saba või mõnda muud oligot (A) sisaldavat järjestust. toimib matriitsina, sarnaselt pikornaviiruse VPg valgu jaoks loodud mehhanismiga (44).Mis saab siis, kui ettepanek on "mittenormatiivne"????(Valgu poolt indutseeritud) negatiivse ahelaga RNA sünteesi käivitamine annab lingi tähelepanekutele, mis näitab, et koronaviiruse negatiivse ahelaga RNA lõpus on UMP (UTP asemel) (42), mis viitab sellele, et nukleiinhape Dicer lõikab otsa, mis on fosforüülitud tundmatu uridiini-spetsiifilise endonukleaasi poolt.Kui see kinnitust leiab, võib see nukleiinhappe hüdrolüütiline aktiivsus aidata vabastada nsp9 oligomeerset UMPüleeritud vormi tekkiva negatiivse ahela 5 ² otsast.Nsp9 võimalik roll valkude praimimisel on kooskõlas ka varasemate pöördgeneetika uuringutega, mis on näidanud, et nsp9 (ja nsp8) interakteeruvad kriitiliselt ja spetsiifiliselt konserveerunud cis-toimiva RNA elemendiga koronaviiruse genoomi 3. otsa lähedal.45).Selle aruande kohaselt saab neid varasemaid tähelepanekuid nüüd edasiste uuringute abil uuesti läbi vaadata ja laiendada.

Kokkuvõttes määrasid meie andmed N-otsas RdRp-ga seotud patenteeritud pesastatud viiruse ensüümi märgise spetsiifilise aktiivsuse.Koronaviiruse puhul kasutatakse seda äsja avastatud NiRAN-vahendatud UMPylator/NMPylator aktiivsust selleks, et tugineda Mn2+ ja külgnevatele Asn jääkidele ning põhjustada (madala energiaga) fosforamidaatsidemete moodustumist N-terminaalse primaarse amiiniga.Mpro-vahendatud lõhustamise kaudu nsp8|9 lõhustamiskohas saab nsp9 sihtmärki kasutada NMPüleerimiseks, mis näitab funktsionaalset sidet proteaasi ja NiRAN domeeni vahel, mis ulatub RdRp-ni.Võtmejääkide säilitamine nsp12 NiRAN-i aktiivses kohas ja nsp9 sihtmärgis koos kahe koronaviiruse, sealhulgas SARS-CoV-2 andmetega, annab kindla tõendi selle kohta, et nsp9 NMPüleerimine on koroonaviirus. Konservatiivsed omadused on samuti viiruse replikatsiooni võtmeetapp.Olemasolevad andmed viivad meid järeldusele, et nsp9 NMPüleeritud vormi spetsiifiline roll valgu poolt indutseeritud RNA sünteesis on koronaviiruse ja teiste pesastatud viiruste jaoks mõistlik stsenaarium ning NiRAN võib olla suunatud ka teistele identifitseerimata valkudele.Reguleerige viirust.Host interaktsioon.Kui kinnitust leiab, suurendab valgupraimerite osalemine viiruse RNA sünteesis Mpro/3CLpro ja RdRp domeenide järjestuse afiinsust varem tuvastatud koroonaviiruse ja pikornaviirusetaolise superrühma (9) vahel, mis on nüüdseks ühendatud hiljuti loodud Pisonivirites ( 46) kategoorias.

Meie andmed näitavad ka, et selles uuringus tuvastatud põhilisi, selektiivseid ja konservatiivseid ensüümi aktiivsusi saab kasutada viirusevastaste ravimite sihtmärkidena.Ühendeid, mis häirivad konserveerunud nsp9 N-otsa seondumist (ja sellele järgnevat modifikatsiooni) NiRANi aktiivses kohas, saab arendada tõhusateks ja mitmekülgseteks viirusevastasteks ravimiteks, mis sobivad erinevatest (alam)perekonna infektsioonidest pärit loomade ja inimeste koronaviiruste raviks. , sealhulgas SARS-CoV-2 ja Lähis-Ida respiratoorse sündroomi koroonaviirus.

Selles uuringus toodetud koroonaviiruse valgu kodeerivat järjestust amplifitseeriti RT-PCR abil, kasutades RNA-d, mis eraldati HCoV-229E-ga nakatunud Huh-7-st või SARS-CoV-2-ga nakatunud Vero E6-st, ja sisestati standardsete kloonimisprotseduuride abil.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) või pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspressioonivektor (SI lisa, tabelid S1 ja S2).Üksikud koodoni asendused viidi sisse PCR-põhise saidipõhise mutageneesi abil (48).MBP sulandvalgu tootmiseks transformeeriti E. coli TB1 rakud sobiva pMAL-c2 plasmiidi konstruktiga (SI lisa, tabel S1).Liitvalk puhastati amüloosi afiinsuskromatograafiaga ja lõhustati faktoriga Xa.Seejärel puhastati C-terminaalne His6-märgistatud valk Ni-immobiliseeritud metalliafiinsuskromatograafiaga (Ni-IMAC), nagu eelnevalt kirjeldatud (49).Ubikvitiini sulandvalgu tootmiseks kasutasid E. coli TB1 rakud sobivat pASK3-Ub-CHis6 plasmiidi konstrukti (SI lisa, tabelid S1 ja S2) ja pCGI plasmiidset DNA-d, mis kodeerib ubikvitiini-spetsiifilist C-terminaalset hüdrolaasi 1 (Ubp1).Transformatsioon (47).C-otsa His6-märgisega koroonaviiruse valk puhastati eelnevalt kirjeldatud viisil (50).

HCoV-229E nsp12-His6 enese-NMPülatsiooni test viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud dokumendis EAV nsp9 (16).Lühidalt öeldes sisaldab nsp12-His6 (0,5 uM) 50 mM 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhapet (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitooli (DTT), 6 mM MnCl2, 25 uM puhvrit. määratud NTP ja 0,17 uM sobisid [a32-P]NTP-ga (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) temperatuuril 30 °C 30 minutit.Kõigis teistes (standardsetes) nsp12-vahendatud nsp9 NMPülatsiooni NMPülatsiooni testides reguleeritakse reaktsioonitingimusi järgmiselt: nsp12-His6 (0,05 uM) ja nsp9-His6 (4 uM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8) juuresolekul. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 uM näidatud NTP ja 0,17 uM sobitatud [a32-P]NTP.Pärast 10-minutilist inkubeerimist 30 °C juures segati reaktsiooniproov SDS-PAGE proovipuhvriga: 62,5 mM tris(hüdroksümetüül)aminometaan-HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glütserool ja 0,005% bromofenool. sinine.Valk denatureeriti kuumutamisel 90 °C juures 5 minutit ja eraldati 12% SDS-PAGE-ga.Geel fikseeritakse ja värvitakse Coomassie Brilliant Blue lahusega (40% metanooli, 10% äädikhapet, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), värvitustatakse ja eksponeeritakse 20 tunniks fosforestseeruva kujutise ekraanile (nsp12 tuvastamiseks NMPülatsioonist). või (maksimaalselt) 2 tundi (nsp9 NMPülatsiooni hindamiseks).Ekraani skannimiseks kasutati Typhoon 9200 kujutist (GE Healthcare) ja signaali intensiivsuse analüüsimiseks ImageJ-d.

MS analüüsi jaoks kasutati NMPülatsiooni analüüsis 1 uM nsp12-His6 ja 10 uM nsp9 (ilma heksahistidiini märgistuseta) (SI lisa, tabel S1) ning 500 uM UTP ja GTP suurenenud kontsentratsiooni.Sõltuvalt nende kontsentratsioonist ja eeldatavast valgukvaliteedist kasutati 1 kuni 10 µl puhverdatud valgulahuste võrgus soola eemaldamiseks MassPrep kolonniga (Waters) varustatud Waters ACQUITY H-klassi HPLC süsteemi.Soolavaba valk elueeritakse Synapt G2Si massispektromeetri (Waters) elektropihustusioonide allikasse läbi järgmise puhvri A (vesi/0,05% sipelghape) ja puhvri B (atsetonitriil/0,045% sipelghape) gradiendi ning kolonni temperatuur on 60 °C ja voolukiirus 0,1 ml/min: elueerimine isokraatiliselt 5% A-ga 2 minutit, seejärel lineaarne gradient 95% B-ni 8 minuti jooksul ja 95% B säilitamine veel 4 minutit.

Tuvastatakse positiivsed ioonid massivahemikus 500–5000 m/z.Glu-fibrinopeptiidi B mõõdetakse iga 45 sekundi järel massi triivi automaatseks korrigeerimiseks.Kasutage MassLynxi instrumenditarkvara koos MaxEnt1 laiendusega, et pärast baasjoone mahaarvamist ja silumist keskmise spektri dekonvolveerida.

UMPüleeritud HCoV-229E nsp9 digereeriti, lisades sekveneerimisklassi modifitseeritud trüpsiini (Serva) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 37 °C.Peptiidide soola eemaldamiseks ja kontsentreerimiseks kasutati Chromabond C18WP tsentrifuugimiskolonni (osa number 730522; Macherey-Nagel).Lõpuks lahustati peptiid 25 µl vees, mis sisaldas 5% atsetonitriili ja 0,1% sipelghapet.

Proove analüüsiti MS-ga, kasutades massispektromeetrit Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Ülim nanoa HPLC süsteem (Dionex), mis on varustatud kohandatud otsakinnitusega 50 cm??75 μm C18 RP kolonn, mis on pakitud 2,4 μm magnethelmestega (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Ühendage massispektromeetriga võrgus Proxeoni nanopihustusallika kaudu;süstida 6 µL trüpsiini seedimise lahust 300 µm siseläbimõõduga x??1 cm C18 PepMap eelkontsentreerimiskolonn (Thermo Scientific).Kasutades lahustina vett/0,05% sipelghapet, püüti proov automaatselt kinni ja magestati voolukiirusel 6 µl/min.

Trüptiliste peptiidide eraldamiseks voolukiirusel 300 nL/min kasutati järgmisi gradiente vee/0,05% sipelghappe (lahusti A) ja 80% atsetonitriili/0,045% sipelghappe (lahusti B) gradiente: 4% B 5 minutit, seejärel 30 A lineaarne gradient 45% B-ni mõne minuti jooksul ja lineaarne tõus 95% lahusti B-ni 5 minuti jooksul.Ühendage kromatograafiline kolonn roostevabast terasest nanoemitteriga (Proxeon) ja pihustage eluent otse massispektromeetri kuumutatud kapillaari, kasutades 2300 V potentsiaali. Orbitrap massianalüsaatori 60 000 eraldusvõimega uuringu skaneerimine on seotud vähemalt kolme andmetega MS/MS-skaneeringud, mis on dünaamiliselt välistatud 30 sekundiks, kasutades lineaarset ioonlõksu kokkupõrkest põhjustatud dissotsiatsiooni või suurema energiaga kokkupõrke dissotsiatsiooni kombineerituna orbitaallõksu tuvastamisega, eraldusvõime on 7500.


Postitusaeg: august 03-2021